3 Tahapan PCR yang Berguna di Bidang Klinis, Ketahui Tujuan dan Jenisnya

Tahap denaturasi adalah tahap awal dalam PCR, di mana DNA yang akan diperbanyak dipanaskan hingga suhu tinggi untuk memecahkan ikatan hidrogen, antara dua untai DNA yang membentuk struktur ganda heliks. Suhu yang digunakan untuk tahap denaturasi biasanya sekitar 95-98 derajat Celsius, dan waktu yang diperlukan tergantung pada panjang dan sifat DNA yang digunakan. Denaturasi yang efisien sangat penting, untuk memastikan bahwa ikatan hidrogen antara dua untai DNA benar-benar terpecah dan untai DNA terpisah dengan sempurna.

2. Annealing

Setelah tahap denaturasi, maka tahapan PCR selanjutnya adalah annealing yang dimulai, di mana suhu turun hingga sekitar 50-65 derajat Celsius (tergantung pada primer yang digunakan), sehingga primer pendek yang komplementer, dengan sekuens DNA yang diinginkan dapat berikatan pada untai DNA yang terpisah. Adapun primer yang digunakan dalam PCR ini, biasanya memiliki panjang sekitar 18-25 basa, dan diperlukan agar spesifik terhadap daerah target DNA yang diinginkan. Tahap annealing berlangsung selama beberapa detik hingga beberapa menit, tergantung pada primer yang digunakan dan suhu yang digunakan.

3. Elongasi

Tahapan PCR terakhir dalam setiap siklus adalah elongasi. Pada tahap ini, suhu dinaikkan hingga sekitar 72 derajat Celsius (suhu optimal untuk aktivitas DNA polimerase), dan DNA polimerase menambahkan nukleotida baru pada untai DNA primer, yang berikatan dengan daerah target DNA. DNA polimerase adalah enzim yang bertanggung jawab atas sintesis untai DNA baru, dan pada tahap ini, enzim akan terus menambahkan nukleotida pada untai DNA primer hingga terbentuk fragmen DNA baru. Waktu elongasi tergantung pada panjang fragmen DNA yang ingin diperbanyak, tetapi umumnya membutuhkan waktu antara 30 detik hingga beberapa menit.

Setelah satu siklus PCR selesai, tahapan-tahapan ini diulangi kembali dari tahap denaturasi hingga tahap elongasi untuk menghasilkan fragmen DNA baru. Jumlah siklus PCR yang dibutuhkan tergantung pada banyak faktor, seperti panjang fragmen DNA yang ingin diperbanyak, jumlah DNA awal yang tersedia, dan spesifikasi primer yang digunakan.

Pada akhirnya, jumlah fragmen DNA yang dihasilkan akan terus bertambah secara eksponensial setiap siklusnya, sehingga menghasilkan jumlah DNA yang cukup untuk diidentifikasi dan dianalisis lebih lanjut. Dalam praktiknya, ada banyak variasi dari tahapan-tahapan dalam PCR yang disesuaikan dengan tujuan spesifiknya. Namun, denaturasi, annealing, dan elongasi tetap menjadi tahapan utama dalam teknik PCR. 

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik biologi molekuler, yang digunakan untuk mengamplifikasi atau memperbanyak fragmen DNA secara eksponensial. Teknik ini sangat penting dalam penelitian biologi, diagnostik penyakit, dan penelitian forensik karena memungkinkan penggandaan dan deteksi sejumlah kecil DNA yang terkandung dalam sampel yang sangat sedikit.

PCR memiliki tujuan dan fungsi yang sangat beragam, di antaranya adalah:

1. Penelitian DNA

PCR digunakan dalam penelitian DNA, untuk mengamplifikasi fragmen DNA tertentu dari sampel DNA. Teknik ini memungkinkan para peneliti untuk mempelajari lebih lanjut, tentang genetika organisme dan memperoleh informasi tentang sekuens DNA yang spesifik. Dalam beberapa kasus, PCR digunakan untuk mengamplifikasi sejumlah besar DNA, yang kemudian dapat diurutkan dan dibandingkan dengan sekuens DNA dari organisme lain.

2. Diagnostik penyakit

PCR digunakan dalam diagnostik penyakit, untuk mendeteksi dan mengamplifikasi DNA atau RNA patogen yang terkait dengan penyakit tertentu, seperti virus dan bakteri. Teknik ini memungkinkan para dokter dan ahli diagnostik untuk membuat diagnosis yang lebih akurat dan cepat, karena mereka dapat mendeteksi DNA atau RNA patogen dengan sangat cepat dan sensitif. PCR juga digunakan untuk mendeteksi mutasi dalam gen tertentu yang dapat memicu penyakit.

3. Identifikasi forensik

PCR digunakan dalam analisis forensik, untuk mengidentifikasi sampel DNA dari sidik jari, rambut, atau bahan biologis lainnya yang ditinggalkan di tempat kejahatan. Teknik ini memungkinkan para penyidik untuk mengidentifikasi pelaku kejahatan atau korban dengan lebih cepat dan akurat, dan juga memungkinkan mereka untuk mengurangi jumlah sampel yang diperlukan untuk melakukan analisis forensik.

4. Teknik manipulasi genetik

PCR digunakan dalam berbagai teknik manipulasi genetik, seperti mutagenesis situs, rekayasa genetika, dan kloning. Teknik ini memungkinkan para peneliti untuk mengamplifikasi fragmen DNA tertentu dan memanipulasi sekuens DNA untuk menghasilkan organisme yang memiliki sifat atau karakteristik tertentu.

1. PCR biasa (conventional PCR)

PCR biasa, juga dikenal sebagai endpoint PCR, adalah jenis PCR yang paling dasar dan sering digunakan. Pada PCR biasa, target DNA diamplifikasi secara eksponensial dengan menggunakan primer khusus dan enzim DNA polymerase. Setelah beberapa siklus amplifikasi, jumlah target DNA yang teramplifikasi akan meningkat secara eksponensial, sehingga memungkinkan deteksi dan analisis lebih lanjut. PCR biasa umumnya digunakan dalam penelitian dasar, seperti sekuensing DNA, identifikasi strain bakteri, dan pengujian keturunan.

2. PCR real-time (qPCR)

PCR real-time menggunakan fluorescent dye atau probe, untuk mengukur jumlah DNA yang teramplifikasi selama reaksi PCR. Fluorescent dye menempel pada fragmen DNA yang teramplifikasi, sedangkan probe mengandung sekuens spesifik yang pasangannya ada pada target DNA. Selama amplifikasi, detektor akan memantau jumlah fluorescent yang terdeteksi setelah setiap siklus, sehingga memungkinkan pengukuran kuantitatif yang lebih akurat daripada PCR biasa. PCR real-time sangat berguna dalam penelitian kuantitatif, seperti ekspresi gen dan deteksi patogen.

3. PCR nested

PCR nested adalah variasi dari PCR biasa. Pada PCR nested, dua pasang primer digunakan pada dua tahap reaksi PCR. Tahap pertama menggunakan pasangan primer pertama yang mencakup wilayah yang lebih luas, sedangkan tahap kedua menggunakan pasangan primer kedua yang mencakup wilayah yang lebih sempit, dan terletak di dalam wilayah yang sudah diamplifikasi pada tahap pertama. Hal ini meningkatkan spesifisitas dan kepekaan deteksi PCR. PCR nested umumnya digunakan dalam deteksi virus, penyakit menular, dan diagnostik genetik.

4. PCR multiplex

PCR multiplex memungkinkan amplifikasi beberapa target DNA sekaligus dalam satu reaksi PCR. Hal ini memungkinkan deteksi beberapa patogen atau mutasi genetik, yang terkait dengan penyakit secara bersamaan dalam satu sampel. Pada PCR multiplex, beberapa pasangan primer spesifik digunakan bersama-sama dalam satu reaksi PCR. PCR multiplex sangat berguna dalam deteksi patogen dan penyakit genetik.

5. Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

RT-PCR digunakan untuk mengamplifikasi RNA menjadi DNA terbalik (cDNA). Teknik ini sering digunakan dalam penelitian ekspresi gen, dan diagnostik penyakit yang melibatkan virus RNA. Pada RT-PCR, RNA diubah menjadi cDNA oleh enzim reverse transcriptase, lalu cDNA diamplifikasi dengan menggunakan PCR biasa atau PCR real-time.

6. Digital PCR (dPCR)

Digital PCR adalah teknologi terbaru dalam amplifikasi DNA. Digital PCR mengukur jumlah DNA dengan cara mendeteksi keberadaannya dalam "partisi" yang berbeda-beda. Setiap partisi mengandung beberapa molekul DNA, atau tidak mengandung sama sekali. Hal ini memungkinkan pengukuran kuantitatif yang sangat akurat dan sangat sensitif. Digital PCR sangat berguna dalam deteksi mutasi gen